双脱氧链终止法

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同义词 桑格测序一般指双脱氧链终止法
双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析
中文名
双脱氧链终止法
外文名
The dideoxy chain termination method
发现年代
1977年
发现者
Sanger
应用范围
DNA基因分析
归属范围
核酸测序技术
原    理
四种单脱氧碱基复制或转录

双脱氧链终止法概述

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双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出。

双脱氧链终止法原理

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核酸模板在核酸聚合酶引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基,只要双脱氧碱基掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3’端的双脱氧碱基,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序

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(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板,模板可以是DNA,也可以是RNA,可以是双链,也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记的ddNTP,例如32P ddNTP和DNA聚合酶(如以RNA为模板,则用反转录酶),再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。
3.与单链模板(如以双链作模板,要作变性处理)结合的引物,在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应,32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时,由于它在3’位置没有羟基,故不与下一个dNTP结合,从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入,因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物,由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP),则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

双脱氧链终止法双脱氧测序的试剂及具体操作步骤

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(以双链DNA测序为例)。

双脱氧链终止法变性双链模板的制备

(1) 材料 Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmo1/L EDTA,50mmo1/L 葡萄糖),1% SDS,0.2mo1/L NaOH,异丙醇,TE缓冲液pH8.0,4mol/L LiCl,冰冷 70%和无水乙醇,2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA。
(2) 配制方法
① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板),离心除去上清液后,用150ml Tris/葡萄糖缓冲液 重悬菌团,在室温下放置5分钟。
② 加入300ml的1%SDS,0.2mol/L NaOH,颠倒混合约15次,在室温下放置15分钟,加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5),颠倒约15次混合,在冰浴中放置45分钟,然后离心5分钟。
③ 将650ml上清液转移至一支新管中,加入650ml异丙醇,混合后在室温下放置10分钟,离心5分钟后弃去异丙醇,抽真空干燥沉淀。
④ 用125ml TE(pH 8.0)重新溶解DNA,加入375ml的4mol/L LiCl,在冰浴中放置20分钟后,于4℃下离心5分钟。
⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提,加入2倍体积的异丙醇,在室温下沉淀30分钟,离心5分钟,弃去上清液。
⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀,离心5分钟,弃去上清液并干燥,用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。
⑦ 取0.2mg质粒DNA,并将体积调至9ml,加入1ml 2mol/L NaOH,2mmol/L EDTA,在室温下放置5分钟,加入2ml 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8ml水。
⑧ 加入6ml冰冷无水乙醇,混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟,在4℃下离心5分钟,小心地弃去上清液,用冰冷的70%乙醇洗沉淀,离心5分钟并小心地弃去上清液,真空抽干沉淀,并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

双脱氧链终止法延伸和终止反应

以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。
(1) 材料 变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中),0.5pmol/mL寡核苷酸引物(溶解在TE中,-20℃贮存),5×测序缓冲液(200mmol/L Tris pH7.5,50mmol/L MgCl2,-20℃贮存),0.1mol/l DTT(当月新配-20℃贮存),15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP),1 000至1 500Ci/mmol32p dATP(在-20℃下达4至6周),修饰的T7 DNA聚合酶,标准酶稀释溶液(20mmol/L Tris-HCl pH7.5,0.5mg/mlBSA,10mmol/L- 巯基乙醇,4℃贮存),终止混合物(表2-30),甲酰胺上样缓冲液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0,10mg溴酚蓝,10mg二甲苯青,10ml甲酰胺)。
表2-30 T7DNA聚合酶终止反应混合物
反应成分 ddG ddA ddT ddC 最终浓度
H2O 15 15 15 15 -
5×测序缓冲液 6 6 6 6 - 1mmol/L
4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L
1mmol/L ddGTP 3 - - - 20μmol/L
1mmol/L ddATP - 3 - - 20μmol/L
1mmol/L ddTTP - - 3 - 20μmol/L
1mmol/L ddCTP - - - 3 20μmol/L
(2) 配制方法
① 取4支0.5ml小离心管,标上G、A、T、C,每管加入7ml变性的双链DNA模板(分别为1和2mg),1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合,65℃保温2分钟,在室温下冷却30分钟。
② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT,2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物,0.5ml32P dATP和2ml(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物,在室温下放置5分钟。
③ 按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。
④ 短促离心后,在37℃下保温5分钟。
⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液,上样前在80℃下加热2分钟,并迅速置于冰浴上,每个样品取3ml,上样电泳。

双脱氧链终止法测序反应物电泳和序列读取

(1) 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。
(2) 按G、A、T、C次序加入每种样品,在G、A和T各泳道上样1ml,而在C泳道上样1.5ml。
(3) 上样完毕加压1700V电泳,根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。
(4) 电泳完毕,在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。
(5) 在60℃或80℃干燥30分钟后,放射自显影读取序列。
读取合成链的核苷酸序列时,应从下往上读取。因为电泳时是从上向下的,即上为负极,下为正极,DNA带负电,从负极向正极移动。其中,小片段DNA移动速度最快,距离正极的点样处最远。所以,应该从最小片段读起,即,从下向上读取。
模板链则应该从上向下读取,并且转换为测序核苷酸的互补的核苷酸。
词条标签:
生物 理学